目前，可選用的顯微鏡設(shè)備和技術(shù)種類很多，本文主要是針對熟悉明場和熒光顯微鏡的讀者。

資料來源：《Live Cell imaging A Laboratory Manual》

作者：Robert D. Goldman，Jason R. Swedlow

01#如何評估一套顯微鏡系統(tǒng)

在選擇使用或購買哪種系統(tǒng)時，第一個要考慮的是哪種參數(shù)對實驗來說是最重要的：速度、靈敏度、分辨率、多波長的識別能力或是細胞的活力，其中的很多參數(shù)之間是互相抵觸的，需要折中考慮。第二個需要考慮的是使用此系統(tǒng)的目的是用于某些特定的檢測，還是用于一般檢測。一般來說，硬件選擇靈活性大的系統(tǒng)更適用于特定檢測，但組裝和使用時有較高的技術(shù)要求。選擇帶有成熟軟件的系統(tǒng)比較節(jié)省時間。無論選擇什么類型的系統(tǒng)，都要先用自己的實驗材料做測試。公司的銷售代表做設(shè)備演示時必須根據(jù)實驗使用的熒光染料和要求的放大倍數(shù)選擇合適的濾光片、激發(fā)光源和物鏡。除了感興趣的生物材料外，還應(yīng)該使用含不同染料的系列玻片，根據(jù)獲得的量化數(shù)據(jù)用于對比不同的系統(tǒng)。

顯微鏡

首先要選擇正置(從上方觀察)還是倒置(從下方觀察)顯微鏡。一般來說，觀察活細胞，要獲得高分辨率的三維圖像時，倒置顯微鏡比較有優(yōu)勢。倒置顯微鏡的載物臺使實驗人員更便于對樣品進行操作，也便于進行顯微注射，并且便于使用環(huán)境可控培養(yǎng)箱。同時，倒置顯微鏡也為CCD相機的安裝提供了更好的機械穩(wěn)定性。

物鏡的選擇

物鏡鏡頭及其使用模式的選擇是影響圖像質(zhì)量的重要參數(shù)。選擇適合封固劑的顯微鏡物鏡對成像來說至關(guān)重要。顯微鏡物鏡可在空氣(通常是低放大倍數(shù))、水浸(WI)或甘油溶液(80%)、硅油或常規(guī)物鏡用油(折射率RI為1.50～1.534)中發(fā)揮作用。物鏡是顯微鏡中最重要的部件，必須定期檢查和清洗。物鏡種類和作用如下：

02#高通量顯微鏡

應(yīng)用于常規(guī)活細胞成像的大部分基本規(guī)則同樣適用于哺乳動物活細胞的高容量篩選的顯微操作。但是由于高通量的要求，高容量篩選成像系統(tǒng)必須滿足一些額外的必要條件。大量商業(yè)化高容量篩選顯微鏡可供選擇。對于基礎(chǔ)研究環(huán)境的高通量成像系統(tǒng)最好不應(yīng)只針對于特定的應(yīng)用，而應(yīng)該具有彈性化、模塊化，能兼容基于一般熒光顯微鏡的許多其它不同檢測。我們應(yīng)特別考慮以下特征：

成像硬件的自動化

與樣品制備過程一樣高，高通量成像需高度自動化，包括焦點自動化鑒定，快門控制的光學曝光、馬達控制熒光濾光片組、數(shù)據(jù)存儲以及不同孔(點)之間的顯微鏡載物臺移動。通常固定1~3個位點，其它位點根據(jù)一定的模式由計算機自動計算?；诔上窈?或)硬件的自動聚焦一般是高容量篩選顯微鏡系統(tǒng)的瓶頸，因此當購買到一臺高容量篩選儀器時，要特別關(guān)注此特征，尤其是在活體樣品時成像的高容量篩選顯微鏡實驗中，依賴一套恰當?shù)淖詣泳劢箼z測策略對獲得理想的時間分辨率是很重要的。自動聚焦有兩種基本策略。第一是基于軟件的自動對焦，即通過圖像來確定聚焦質(zhì)量(如在不同焦距層中確定最高變異度或優(yōu)化圖像中的聚焦物體數(shù)目)。此技術(shù)的優(yōu)點是直接聚焦在感興趣的結(jié)構(gòu)上，使它們始終保持在焦點，而不管它們到細胞支持物的距離。然而，以圖像為參照的自動聚焦程序通常很慢。在此方法中，在不同的焦平面要獲得多個圖像，而且在聚焦過程中活體樣品曝光量很大，增加了樣品光漂白速度，同時增加了光毒性。第二種策略是基于硬件進行的聚焦點鑒定，即通過近紅外光反射來測量細胞支持物，如蓋波片位置。圖像收集的理想焦距位置可以通過使用者設(shè)定對自動檢測出細胞支持物的位置進行抵消，也可以通過額外再加上基于圖像的自動聚焦程序。硬件自動聚焦通常比圖像聚焦鑒定快，顯著降低了光漂白和光毒性。硬件自動聚焦的缺點是需要額外的硬件系統(tǒng)，而且在聚焦過程中只對細胞支持物聚焦。因此在整個實驗過程中，只有樣品位于細胞支持物同一位置時，才能對樣品精確聚焦。硬件自動聚焦很少用于長時間觀察，因為附著細胞經(jīng)常部分解離，或者在有絲分裂過程中圓形化以及胚胎在發(fā)育過程中改變形態(tài)。

穩(wěn)定性

在時程實驗中，成像條件長時間的穩(wěn)定性是定量成像分析的基本條件，只有當成像條件在短時間和長時間都能保持恒定時，在不同時間段內(nèi)進行的實驗才具有可比性，下述顯微鏡部件在高容量篩選顯微鏡實驗中必須優(yōu)化。

激發(fā)光源。對于定量分析，在整個實驗過程中持續(xù)穩(wěn)定的光強度是必要的。這可以通過使用非常穩(wěn)定的光源得以證明，如發(fā)光二極管(LED)或者監(jiān)測和調(diào)整燈溫度和光強度的穩(wěn)定光源。另有一選擇是自動曝光，在不同實驗中可保持成像強度的持續(xù)性。

自動曝光。此特征確保只有幾個飽和像素并使用相機的動態(tài)范圍。在高容量篩選實驗中，重點確定最小和最大曝光時間，并將獲取的灰度值轉(zhuǎn)化為反映樣品的熒光強度可比值?？赏ㄟ^校準選定的最小、最大強度的不同曝光時間和激發(fā)光強度而實現(xiàn)。

馬達驅(qū)動的x-y顯微鏡載物臺。在高容量篩選時程實驗中，載物臺在幾百個位點之間重復(fù)移動。為保證每個x-y位點在時間進程中盡可能保持穩(wěn)定以避免成像分析時的問題，應(yīng)獲得nm級高重復(fù)性準確性。

環(huán)境控制。溫度波動可導致焦距漂移，造成可靠性成像困難，也影響細胞中很多生物過程；也就是說，在實驗時間段內(nèi)上下浮動1℃可引起明顯變化。有不同類型的顯微鏡恒溫箱，小型的只控制培養(yǎng)皿，大型的控制整個顯微鏡鏡體。

聚焦穩(wěn)定性。自動聚焦檢測起始后，非常穩(wěn)定的顯微鏡鏡架和恒定溫度足夠保持焦距穩(wěn)定性。如果檢測期間聚焦穩(wěn)定性不夠或者細胞沿z軸方向在細胞支持物上上下移動，可以應(yīng)用自動調(diào)焦系統(tǒng)來解決這個問題，但會降低時間分辨率、增加細胞毒性和光漂白，這在前面的內(nèi)容中已有討論。

兼容性

高通量篩選顯微鏡實驗需要大量樣本，產(chǎn)生龐大的數(shù)據(jù)組。高通量篩選顯微鏡設(shè)置應(yīng)與樣本制備和數(shù)據(jù)儲存兼容，以便優(yōu)化工作流程，并將獲取的圖像與初始樣本(siRNA/cDNA/化合物)的圖像分析結(jié)果聯(lián)系起來。對于數(shù)據(jù)存儲，常用文件格式不必為圖像處理轉(zhuǎn)變格式、圖像收集過程中自動存入指定文件形式和連接到數(shù)據(jù)庫的可能性都是重要的。

編輯：hfy