多細(xì)胞肝球作為一種3D培養(yǎng)模型，可用于肝纖維化治療的研究，雖然這些模型可以再現(xiàn)纖維化疾病，然而目前通過(guò)隨機(jī)分配方法制造的細(xì)胞球不易控制，在大小、功能和效用上存在著差異。近日，來(lái)自美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的Adam R Abate團(tuán)隊(duì)在Biofabrication上發(fā)表題為“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”的研究新成果。研究人員利用微流控流式細(xì)胞打印（μFCP）技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞打印，得到具有確定數(shù)量的不同細(xì)胞類型的肝球。該技術(shù)制造的細(xì)胞球在結(jié)構(gòu)與功能上的均勻性均優(yōu)于隨機(jī)分配方法生成的細(xì)胞球。此外，該技術(shù)每小時(shí)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)細(xì)胞球，可批量制造單細(xì)胞精度的球狀體，為疾病建模和高通量藥物測(cè)試提供可擴(kuò)展平臺(tái)。

μFCP技術(shù)工作原理

細(xì)胞識(shí)別及分揀是實(shí)現(xiàn)精確分配細(xì)胞的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)的FACS工作原理一樣，μFCP技術(shù)通過(guò)熒光和散射特性鑒定出目標(biāo)細(xì)胞，并從流體中分揀出來(lái)。不同之處是，該技術(shù)提出了介電泳液滴偏轉(zhuǎn)裝置，利用導(dǎo)電液滴和周圍絕緣空氣之間的介電常數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的分揀。該裝置體積小至毫米，因此允許靠近接收板，從而提高打印精度。當(dāng)載有目標(biāo)細(xì)胞如肝細(xì)胞（HepG2）或肝星狀細(xì)胞（HSC）的液滴流過(guò)分揀區(qū)域時(shí)，液滴將按需沉積在所需孔內(nèi)，最終形成功能性肝球（如圖1）。

圖1 μFCP技術(shù)制造功能性肝球示意圖

μFCP技術(shù)制造的細(xì)胞球具有更好的細(xì)胞存活率

當(dāng)用懸浮細(xì)胞組成細(xì)胞球時(shí)，并非所有的細(xì)胞都是活的，隨機(jī)分配法會(huì)將死亡的細(xì)胞也包含在在細(xì)胞球中，導(dǎo)致細(xì)胞球的特征發(fā)生改變。相比之下，μFCP技術(shù)可以使用活性染料辨別出死細(xì)胞并將其排除，從而提高細(xì)胞球活性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究人員將Calcein AM染色后的細(xì)胞分別通過(guò)隨機(jī)分配法和μFCP技術(shù)打印在基底上（如圖2），結(jié)果表明μFCP技術(shù)獲得的細(xì)胞群體具有更高的平均熒光，且暗淡的細(xì)胞較少。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行EthD-1染色，也同樣觀察到μFCP技術(shù)下的死細(xì)胞更少。

圖2 μFCP技術(shù)可分揀活細(xì)胞，以提高細(xì)胞球活性

μFCP技術(shù)制造的細(xì)胞球大小和細(xì)胞組分精準(zhǔn)可控

細(xì)胞球的大小取決于培養(yǎng)時(shí)間和初始細(xì)胞數(shù)量。為了說(shuō)明μFCP技術(shù)在控制細(xì)胞球大小方面的優(yōu)越性，研究人員使用μFCP和隨機(jī)分配兩種技術(shù)打印了不同初始細(xì)胞數(shù)量。與隨機(jī)分配方法相比，μFCP技術(shù)打印的細(xì)胞球尺寸分布更集中（圖3a）。為了展現(xiàn)μFCP技術(shù)具有精準(zhǔn)控制細(xì)胞球成分的能力，研究人員使用這兩種方法構(gòu)建了目標(biāo)成分為10個(gè)HepG2和10個(gè)HSC的細(xì)胞球，μFCP制造的細(xì)胞球細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)誤差明顯小于隨機(jī)分配（圖3b），并且在培養(yǎng)六天后的尺寸變化比隨機(jī)分配所產(chǎn)生的細(xì)胞球小三倍（圖3c）。

圖3 μFCP技術(shù)允許打印的細(xì)胞數(shù)目可控，以獲得更均勻的肝細(xì)胞球

μFCP技術(shù)制造的肝細(xì)胞球功能可控

纖維化取決于肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞之間的相互作用。因此，這些細(xì)胞比例的變化可能導(dǎo)致不一致的細(xì)胞球功能。為了研究細(xì)胞比例對(duì)肝球表型和纖維化的影響，研究人員打印了不同比例的HepG2和HSC細(xì)胞球，每個(gè)細(xì)胞球共有100個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)6天后，細(xì)胞球大小隨著HSC數(shù)量的增加而減小（圖4a、b），且球體形態(tài)趨于球形（圖4c）。但當(dāng)HSC增加超過(guò)60%會(huì)導(dǎo)致球體形態(tài)不規(guī)則。為了更深入地研究這一點(diǎn)，研究人員量化了I型膠原蛋白的生成，當(dāng)HSC占比低于50%時(shí)，I型膠原蛋白總量隨HSC數(shù)量線性增加，反之下降（圖4e、f），這表明當(dāng)HepG2過(guò)少時(shí)，HSC不再分泌膠原蛋白。

圖4 μFCP技術(shù)允許系統(tǒng)化研究細(xì)胞類型的比例和數(shù)量對(duì)肝球的影響

μFCP技術(shù)制造的細(xì)胞球可以實(shí)現(xiàn)更精確的藥物篩選

使用細(xì)胞球進(jìn)行藥物篩選時(shí)，其大小和功能均勻性直接影響準(zhǔn)確性。由于μFCP允許制造具有優(yōu)異均勻性的細(xì)胞球，因此與隨機(jī)分配方法相比，它能夠?qū)崿F(xiàn)更精確的篩選。為了評(píng)估藥物反應(yīng)的可變性，研究人員通過(guò)打印或隨機(jī)分配的方式，用60個(gè)HepG2和40個(gè)HSC細(xì)胞制作了細(xì)胞球（圖5a）。然后使用TGF-β1促纖維化化合物處理細(xì)胞球，這是一種對(duì)HSC活化的有效刺激，可產(chǎn)生I型膠原（圖5b、c）。為了比較功能均勻性，研究人員通過(guò)計(jì)算I型膠原面積來(lái)量化I型膠原的數(shù)量（圖5d），發(fā)現(xiàn)TGF-β1顯著增加μFCP打印細(xì)胞球和隨機(jī)生成細(xì)胞球中的I型膠原，與隨機(jī)分配的細(xì)胞球相比，打印細(xì)胞球的測(cè)量可變性降低，大大增加了藥物影響的統(tǒng)計(jì)顯著性。

圖5 μFCP技術(shù)制造的細(xì)胞球用于體外藥物精準(zhǔn)測(cè)試

目前基于隨機(jī)分配制造的肝細(xì)胞細(xì)胞球存在尺寸和功能可變的問(wèn)題，這限制了它們?cè)佻F(xiàn)肝臟生物學(xué)和纖維化的重復(fù)性，以及作為篩選模型的準(zhǔn)確性。研究人員采用的微流控流式細(xì)胞打印技術(shù)克服了這些問(wèn)題，確保了細(xì)胞球由所需細(xì)胞類型的確切數(shù)量組成。此外，若將該技術(shù)與多路復(fù)用光學(xué)檢測(cè)相結(jié)合，可進(jìn)一步增加細(xì)胞球的復(fù)雜度，這將有利于細(xì)胞球功能的精準(zhǔn)控制。