外泌體和其他小細(xì)胞外囊泡 (sEV) 是細(xì)胞間通訊和代謝調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)，包含蛋白質(zhì)、編碼和非編碼 RNA、DNA和代謝物，存在于生物體的體液中，包括血漿/血清、尿液和腦脊液。sEV內(nèi)容物受生理和病理狀態(tài)影響，因此它們可用作診斷和預(yù)測(cè)多種疾病預(yù)后的標(biāo)志物。過(guò)去的研究主要針對(duì)sEV中miRNA，而對(duì)蛋白質(zhì)組的研究較少。本文作者利用質(zhì)譜技術(shù)研究不同細(xì)胞系分泌sEV中的蛋白質(zhì)組特征，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類(lèi)型的sEV中蛋白質(zhì)的獨(dú)特性質(zhì)，以及這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平如何用作識(shí)別組織來(lái)源的生物標(biāo)志物。

02圖解摘要

通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)，作者確定了來(lái)自多種細(xì)胞類(lèi)型的外泌體/sEV共有的標(biāo)志物，以及每種細(xì)胞類(lèi)型獨(dú)有的標(biāo)志物。使用脂肪營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型，揭示了sEV蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)循環(huán)外泌體/sEVs的起源組織的用途。

03研究?jī)?nèi)容

1、細(xì)胞產(chǎn)生的sEVs具有不同的蛋白質(zhì)組特征

研究者從5個(gè)代謝調(diào)節(jié)小鼠模型細(xì)胞系提取外泌體和sEVs，大小在50到200納米之間，并通過(guò)NTA分析確定大小分布在5個(gè)細(xì)胞系中沒(méi)有區(qū)別，但各細(xì)胞系釋放顆粒的速度有很大區(qū)別，分化的3T3-L1釋放sEVs最快，而分化的C2C12釋放的最慢。為了探究這些不同細(xì)胞釋放的sEVs中蛋白質(zhì)組的差異，研究者利用LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)組成，共鑒定到431種蛋白質(zhì)。GO富集分析結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)多為胞外蛋白（細(xì)胞表面或分泌蛋白），或位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上，功能上主要參與蛋白質(zhì)代謝、大分子處理、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)。利用PCA分析將5個(gè)細(xì)胞系分為2個(gè)clusters，一個(gè)包含C2C12（肌管）和AML12（肝細(xì)胞），一個(gè)包含3T3-L1（脂肪細(xì)胞）、BrAd和SVEC（內(nèi)皮細(xì)胞）。通路富集分析表明，內(nèi)皮細(xì)胞與白色和棕色脂肪細(xì)胞釋放的sEV富集了參與分解代謝過(guò)程和有機(jī)酸、羧酸、氮化合物代謝的蛋白質(zhì)，且差速離心法分離出的sEVs中檢測(cè)到了10種糖酵解途徑中的酶。內(nèi)皮細(xì)胞與棕色和白色脂肪細(xì)胞的sEVs富集了脂肪酸合成和脂蛋白代謝的重要酶蛋白。肝細(xì)胞和肌管釋放的sEVs參與細(xì)胞遷移/黏附、免疫反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和脂質(zhì)與甘油磷脂代謝。這些結(jié)果表明，盡管這些細(xì)胞系存在顯著的代謝差異，但它們的sEVs中蛋白質(zhì)組存在意想不到的相似性，將這些細(xì)胞系分成2種模式。

Fig.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和各細(xì)胞類(lèi)型釋放的sEV的表征

Fig.2 在分離的sEV中觀察到的蛋白質(zhì)組表達(dá)模式

2、不同細(xì)胞系sEV蛋白marker鑒定

Tetraspanins家族蛋白CD63、CD9和CD81，在過(guò)去研究表明，在sEV中表達(dá)豐富，因此常常被用作sEV鑒定、定量或純化的marker。然而，在研究者的結(jié)果中，這三個(gè)蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞系中的表達(dá)水平有很大差異。脂肪和肌管細(xì)胞系中的sEVs表達(dá)水平高，但在內(nèi)皮細(xì)胞和白色與灰色脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平低。相反，研究者從自己的質(zhì)譜結(jié)果中鑒定到6個(gè)在sEV中表達(dá)水平相似的蛋白質(zhì)，可能是更好的sEV蛋白marker，分別是ENO1、GPI、HSPA5、YWHAB、CNTN1和CSF1R。前四個(gè)蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)定位于sEV管腔，后兩個(gè)被歸為膜蛋白，因此也可以作為表面marker。

用WB對(duì)5種細(xì)胞系特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，鑒定了每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的特異性marker，即3T3L1：ADIPOQ、CD36；AML12：EGFR、ITGB1；C2C12：SPARC、IGFBP5；SVEC：HSP90；BrAd：POSTN、THBS1。此外，進(jìn)入sEVs的蛋白質(zhì)可能與這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞類(lèi)型的豐度和外泌體分泌通路有關(guān)。WB結(jié)果表明，一些蛋白質(zhì)在sEV和細(xì)胞的表達(dá)水平成比例，如ADIPOQ、SPARC、FASN、IGFBP5。而其他一些蛋白在某些細(xì)胞類(lèi)型的sEVs中與其他細(xì)胞類(lèi)型相比顯著上調(diào)，而在細(xì)胞表達(dá)水平相似，表明存在細(xì)胞類(lèi)型特異性機(jī)制使得這種蛋白被分選進(jìn)入sEV中。從培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞提取sEV并用質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞（3T3-L1）sEV特異表達(dá)的蛋白也富集在原代細(xì)胞sEV中，表明兩種來(lái)源的sEV蛋白質(zhì)組非常相似。

Fig.3 Tetraspanins在不同細(xì)胞類(lèi)型的sEV中表達(dá)并不相同

Fig.4每種細(xì)胞類(lèi)型SEV標(biāo)志物的免疫印跡

3、血清sEV蛋白作為代謝性疾病組織變化的指標(biāo)

為了確定sEV蛋白質(zhì)組是否發(fā)生改變并可能有助于代謝表型，研究者從12周大的對(duì)照和 AdicerKO小鼠中分離出血清sEV，并對(duì)它們進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。其中86個(gè)蛋白質(zhì)在對(duì)照和KO小鼠之間表達(dá)不同，AdcerKO的sEV中40個(gè)上調(diào)和46個(gè)下調(diào)。富集分析表明上調(diào)通路top10中包含視黃醇代謝和補(bǔ)體激活途徑，下調(diào)通路top10中包含炎癥反應(yīng)和鐵代謝。有趣的是，表達(dá)水平高度變化的蛋白質(zhì)包括通常由肝臟、脂肪和其他組織分泌的蛋白質(zhì)。為了追蹤AdicerKO sEV中顯著改變的蛋白質(zhì)的來(lái)源，研究者將這些蛋白質(zhì)中的每一種與前文確定的細(xì)胞類(lèi)型特異sEV蛋白質(zhì)的體外數(shù)據(jù)交互分析，發(fā)現(xiàn)其中三種在KO模型中上調(diào)的蛋白來(lái)自肝細(xì)胞，只有一種蛋白質(zhì)來(lái)自SVEC且在KO模型中上調(diào)表達(dá)，25種蛋白質(zhì)來(lái)自肌肉細(xì)胞，其中12種上調(diào)，13種下調(diào)。重要的是，有5種蛋白可能是脂肪細(xì)胞特異的，且這些蛋白在sEV的表達(dá)變化與對(duì)應(yīng)組織中該蛋白的表達(dá)水平變化一致。這些數(shù)據(jù)表明，血清sEV中蛋白質(zhì)豐度的變化可以反映組織質(zhì)量和組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，這些組織選擇性地將這些蛋白質(zhì)輸出到它們的sEV中。

Fig.5 AdicerKO小鼠血清sEV蛋白質(zhì)組的變化

4、脂聯(lián)素作為白色脂肪細(xì)胞sEV的標(biāo)志物

脂肪因子ADIPOQ是一種重要的胰島素增敏劑，由脂肪細(xì)胞獨(dú)特分泌，是白色脂肪sEV獨(dú)特的標(biāo)志物。HMW脂聯(lián)素是其主要的生物活性形式，在與其受體AdipoR1/2結(jié)合時(shí)，以組織依賴性方式激活A(yù)MPK或PPARγ通路。此外，HMW脂聯(lián)素與內(nèi)皮細(xì)胞中的 T-鈣粘蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)血管形成，并已被證明可刺激sEV釋放。免疫金標(biāo)法證實(shí)sEV中存在ADIPOQ，sEV分離前后血清進(jìn)行WB和ELISA分析發(fā)現(xiàn)血清中的大部分ADIPOQ是游離的，sEV組分中僅存在一小部分，其主要存在形式為MMW和HMW。在AdcerKO小鼠中，血清和sEV中兩種形式的豐度均有所下降?？紤]到對(duì)照和AdicerKO小鼠的sWAT中的ADIPOQ蛋白表達(dá)相似，這可能是由于在KO組中觀察到的脂肪營(yíng)養(yǎng)不良而發(fā)生的。為了確定sEV中的ADIPOQ是在囊泡表面還是在囊泡內(nèi)腔中，研究者在用Triton X-100破壞囊泡膜之前和之后都用蛋白酶K處理了sEVs，發(fā)現(xiàn)蛋白酶K能夠在添加去污劑前后消化與sEV相關(guān)的ADIPOQ。因此，ADIPOQ是位于這些sEV外膜上的白色脂肪細(xì)胞sEV的獨(dú)特標(biāo)志物，有可能與 ADIPOQ受體結(jié)合并影響這些外泌體/sEVs的靶向性。

Fig.6 高分子量ADIPOQ在AdicerKO小鼠sEV中表達(dá)下調(diào)

04結(jié)果總結(jié)

本研究對(duì)可代表重要代謝組織的五種細(xì)胞系進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)每一種細(xì)胞類(lèi)型都有獨(dú)特的sEV蛋白質(zhì)組表達(dá)模式。雖然 CD9/CD63/CD81等經(jīng)典sEV標(biāo)志物的豐度差異很大，但研究者還確定了六種sEV標(biāo)志物（ENO1、GPI、HSPA5、YWHAB、CSF1R 和CNTN1）。它們?cè)谒屑?xì)胞類(lèi)型的sEV中豐度相似。此外，每種細(xì)胞類(lèi)型都有特定的sEV標(biāo)志物。使用白色脂肪組織減少和棕色脂肪組織增加的脂肪特異性Dicer敲除小鼠，研究者證實(shí)這些細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)血清sEV的變化起源。這些結(jié)果為了解在代謝穩(wěn)態(tài)中重要的細(xì)胞和組織的sEV蛋白質(zhì)組、識(shí)別獨(dú)特的sEV標(biāo)志物以及證明這些標(biāo)志物如何幫助預(yù)測(cè)血清sEV的組織來(lái)源提供了寶貴的資源。

審核編輯：郭婷