抗生素耐藥性（Antibiotic resistance，AR）危機(jī)在全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重。抗生素耐藥性的增加很大程度上是由于在人類醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)以及畜牧業(yè)中對(duì)抗生素的過(guò)度使用而導(dǎo)致的。抗生素耐藥性由多種因素引起，包括過(guò)度使用抗生素、缺乏可確定抗生素敏感性的快速實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，以及使用無(wú)效或效果較差的抗生素等。因此，推進(jìn)抗生素敏感性快速測(cè)試技術(shù)的開發(fā)和使用，以識(shí)別和表征耐藥細(xì)菌，從而有針對(duì)性地給藥是對(duì)抗抗生素耐藥性的關(guān)鍵。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近日，美國(guó)康奈爾大學(xué)（Cornell University）研究人員開發(fā)了一種具有梯度設(shè)計(jì)的微流控系統(tǒng)，可產(chǎn)生與當(dāng)前國(guó)家和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)?倍連續(xù)稀釋的抗生素。研究人員的整合設(shè)計(jì)，通過(guò)最少的處理步驟，將抗生素敏感性測(cè)試時(shí)間從16~20小時(shí)縮短至4~5?小時(shí)。研究人員的可行性測(cè)試結(jié)果與商用抗生素敏感性測(cè)試（AST）結(jié)果一致，從尿路感染（UTI）的犬類中分離的革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的一致性顯示為91.75%，并且可在沒(méi)有預(yù)先分離或濃縮的情況下使用。該微流控平臺(tái)為抗生素敏感性測(cè)試提供了一種高效、適應(yīng)性強(qiáng)的診斷工具。

系統(tǒng)說(shuō)明

用于抗生素敏感性測(cè)試的梯度微流控系統(tǒng)結(jié)合了基于納升級(jí)微腔室的抗生素敏感性測(cè)試的方法與梯形濃度梯度發(fā)生器（LCGG）裝置。這種組合為快速實(shí)現(xiàn)抗生素敏感性測(cè)試提供了標(biāo)準(zhǔn)化和可調(diào)控的抗生素濃度分布。該平臺(tái)由與傳統(tǒng)載玻片結(jié)合的圖案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）層組成，可使每個(gè)裝置測(cè)試一種抗生素/細(xì)菌組合。每個(gè)裝置提供10種2倍稀釋濃度，并在每種濃度的“一式三份”微腔室中進(jìn)行測(cè)試，其中包括陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照（無(wú)抗生素）微腔室。微腔室從梯形濃度梯度發(fā)生器的主要通道中分支出來(lái)，用作生物反應(yīng)器，在抗生素中培養(yǎng)細(xì)菌。

圖1：梯度微流控系統(tǒng)設(shè)計(jì)及工作原理

裝置的設(shè)計(jì)和仿真

該裝置的一個(gè)關(guān)鍵工程挑戰(zhàn)是匹配稀釋劑（純培養(yǎng)基）與進(jìn)入的抗生素的流速，并在每個(gè)環(huán)路處產(chǎn)生2倍稀釋。在沒(méi)有任何控制功能的情況下，稀釋劑將僅能到達(dá)環(huán)路的一半，因?yàn)樽枇ψ钚〉穆窂绞歉浇某隹?，流體可以從此處流出系統(tǒng)。研究人員通過(guò)增加側(cè)通道上的液壓阻力來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，從而驅(qū)動(dòng)稀釋劑到達(dá)所有環(huán)路。在研究人員設(shè)計(jì)的梯度結(jié)構(gòu)中，所需濃度分布的阻力近似值可通過(guò)電路邏輯模型來(lái)計(jì)算。

研究人員使用計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)（CFD）仿真來(lái)確定收縮的液壓阻力作為其長(zhǎng)度的函數(shù)（圖2b~2d）。計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，?40?μm x 655?μm（寬度x長(zhǎng)度）的縮窄具有與混合器相同的液壓阻力（圖2d）。

圖2：計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)模擬和壓力節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

操作原理

梯度微流控系統(tǒng)的操作遵循研究人員之前制定的方案。研究人員使用標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯來(lái)制備所有溶液，?添加2%v/v PrestoBlue（細(xì)胞活力檢測(cè)試劑）作為細(xì)胞代謝指標(biāo)。該平臺(tái)的加載包括以下三個(gè)步驟：（1）使用注射器將細(xì)菌懸浮液加載到裝置中；（2）使用注射泵將培養(yǎng)基中的抗生素溶液和清潔培養(yǎng)基通過(guò)兩個(gè)不同的端口加載到裝置中，以在主通道網(wǎng)絡(luò)中產(chǎn)生濃度分布。這一步驟沖走了主通道中的細(xì)菌，但留下了那些在終端微室中的細(xì)菌?？股馗鶕?jù)特定的藥物加載時(shí)間擴(kuò)散到微腔室中；（3）系統(tǒng)加載生物級(jí)礦物油以隔離微腔室。一旦微腔室被密封，芯片上的水浴池就裝滿了水，然后該裝置在37?°C下培養(yǎng)?4~5小時(shí)。

在細(xì)菌加載、抗生素加載和微腔室密封這三個(gè)步驟中，只有步驟2的加載時(shí)間隨所測(cè)試的抗生素的不同而變化。表征抗生素加載到微腔室和產(chǎn)生的濃度分布是最重要的，以確定該系統(tǒng)的操作程序。

圖3：梯度濃度的表征

對(duì)臨床分離株進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試

研究人員用來(lái)自犬尿路感染樣本中的細(xì)菌分離物檢測(cè)梯度微流控系統(tǒng)在確定最低抑菌濃度（MIC）時(shí)的性能特征，這些樣本被提交給康奈爾動(dòng)物健康診斷中心（AHDC）進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試（圖4a）。研究人員重點(diǎn)研究了2007~2017年間在該設(shè)施培養(yǎng)的犬尿路感染中最常見的四種傳染性微生物：大腸桿菌（EC）、奇異變形桿菌（PRM）、糞腸球菌（EF）和假中間葡萄球菌（SP）。研究人員總共檢測(cè)了30株細(xì)菌分離株。這四種細(xì)菌占所有病例的66.7%。

圖4：梯度微流控系統(tǒng)對(duì)臨床獸醫(yī)樣本中細(xì)菌分離物抗生素敏感性測(cè)試效果

綜上所述，研究人員設(shè)計(jì)、優(yōu)化并使用了一種進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的梯度微流控系統(tǒng)；包含標(biāo)準(zhǔn)化、易理解的測(cè)試參數(shù)；然后測(cè)試從培養(yǎng)皿分離出的細(xì)菌或直接從尿液樣品分離的細(xì)菌。該系統(tǒng)利用階梯狀網(wǎng)絡(luò)生成連續(xù)2倍稀釋的濃度，遵循當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)化方法和規(guī)定，并且可調(diào)節(jié)以適應(yīng)大量臨床相關(guān)的抗生素和抗生素組合。當(dāng)使用單一抗生素測(cè)試時(shí)，包括細(xì)菌加載、抗生素加載和油加載在內(nèi)的總制備時(shí)間，最快可達(dá)10分鐘，而抗生素組合測(cè)試也不超過(guò)15分鐘。該梯度微控控系統(tǒng)的一個(gè)重點(diǎn)考慮因素是在微尺度和小空間內(nèi)對(duì)抗生素進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋。該梯度微流控系統(tǒng)是迄今為止第一個(gè)使用電路邏輯在微流控中產(chǎn)生梯度濃度的系統(tǒng)。

醫(yī)療設(shè)備想要通過(guò)審批，需要與如敏化獸醫(yī)尿路感染臺(tái)（SVU）等金標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備達(dá)成95%以上的一致性，因此，盡管梯度微流控芯片很有前景，但仍缺乏可接受性。未來(lái)，梯度微流控系統(tǒng)應(yīng)采用自動(dòng)上料、樣品處理、實(shí)時(shí)圖像分析等技術(shù)，以提高過(guò)程的準(zhǔn)確性。此外，還應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的臨床研究，以擴(kuò)大抗生素敏感性測(cè)試平臺(tái)的使用范圍，直接從含有更多相關(guān)細(xì)菌/抗生素的樣本中提取并進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)檢查尿路感染以外的其它疾病模型，以探索該梯度微流控系統(tǒng)在臨床診斷中的其它用途。

審核編輯：劉清