鎖相放大器用于生物樣品雙通道和多儀器模式SRS顯微技術(shù)的研究

一．簡(jiǎn)介

拉曼散射光譜為生物分子的特異性檢測(cè)和分析提供了化學(xué)鍵的固有振動(dòng)指紋。那么什么是受激拉曼散射顯微鏡？受激拉曼散射(SRS)顯微技術(shù)是一種相對(duì)較新的顯微技術(shù)，是一種相干拉曼散射過(guò)程，允許使用光譜和空間信息進(jìn)行化學(xué)成像[18]，由于相干受激發(fā)射過(guò)程[1]能產(chǎn)生約103-105倍的增強(qiáng)拉曼信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)視頻速率(約25幀/s)[2]的高速成像。SRS顯微鏡繼承了自發(fā)拉曼光譜的優(yōu)點(diǎn), 是一種能夠快速開(kāi)發(fā)、label-free的成像技術(shù)，同時(shí)具有高靈敏度和化學(xué)特異性[3-6], 在許多生物醫(yī)學(xué)研究的分支顯示出應(yīng)用潛力,包括細(xì)胞生物學(xué)、脂質(zhì)代謝、微生物學(xué)、腫瘤檢測(cè)、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和制藥[7-11]。特別的是，SRS在對(duì)新鮮手術(shù)組織和術(shù)中診斷的快速組織病理學(xué)方面表現(xiàn)出色，與傳統(tǒng)的H&E染色幾乎完全一致[12,13]。此外，SRS能夠根據(jù)每個(gè)物種的光譜信息，對(duì)多種組分的混合物進(jìn)行定量化學(xué)分析[6,7,14]。

盡管在之前的研究[17]中已經(jīng)研究了痛風(fēng)中MSU的自發(fā)拉曼光譜，但微弱的信號(hào)強(qiáng)度阻礙了其用于快速組織學(xué)的應(yīng)用。因此，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院華英匯教授 和復(fù)旦大學(xué)物理學(xué)系季敏標(biāo)教授團(tuán)隊(duì)將受激拉曼散射顯微技術(shù)用于人體痛風(fēng)組織病理成像[15]。研究人員應(yīng)用SRS和二次諧波（SHG）顯微鏡同時(shí)表征了晶型和非晶型MSU。在普通光鏡下，MSU晶體呈典型的針狀。這些晶體在拉曼峰630 cm-1的SRS上很容易成像，當(dāng)SRS頻率稍微偏離振動(dòng)共振時(shí)，表現(xiàn)出了高化學(xué)特異性的非共振行為，SRS信號(hào)消失。已知SHG對(duì)非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)敏感，包括MSU晶體和[17]組織中的膠原纖維。然而，由于拉曼極化率張量和二階光學(xué)磁化率對(duì)晶體對(duì)稱性[16]的依賴，研究者們發(fā)現(xiàn)線偏振光光束在晶體取向上傾向于產(chǎn)生SRS和SHG的強(qiáng)各向異性信號(hào)。因此，研究者們對(duì)泵浦光束和斯托克斯光束都應(yīng)用了圓偏振，以消除MSU晶體和膠原纖維的定向效應(yīng)。

Moku:Pro 的鎖相放大器 (LIA) 為受激拉曼散射 (SRS) 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中的自外差信號(hào)檢測(cè)提供了一種直觀、精確且穩(wěn)健的解決方案。高質(zhì)量的 LIA 是 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中具有調(diào)制傳輸檢測(cè)方案的關(guān)鍵硬件組件。在此更新的案例研究中，我們提供了有關(guān)雙 LIA 應(yīng)用程序的更多詳細(xì)信息和描述。

由于SRS 是一種相干拉曼散射過(guò)程，允許使用光譜和空間信息進(jìn)行化學(xué)成像[18]。它使用兩個(gè)同步脈沖激光器，即泵浦和斯托克斯（圖 1）相干地激發(fā)分子的振動(dòng)。當(dāng)入射到樣品上的兩束激光的頻率差與目標(biāo)分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，就會(huì)發(fā)生 SRS 過(guò)程。振動(dòng)激發(fā)的結(jié)果是泵浦光束將失去光子，而斯托克斯光束將獲得光子。當(dāng)檢測(cè)到泵浦光束的損失時(shí)，這稱為受激拉曼損失 (SRL) 檢測(cè)。強(qiáng)度損失 ΔI?/I? 通常約為 10 -7 -10 -4，遠(yuǎn)小于典型的激光強(qiáng)度波動(dòng)。為了克服這一挑戰(zhàn)，需要一種高頻調(diào)制和相敏檢測(cè)方案來(lái)從嘈雜的背景中提取 SRS 信號(hào)[19]。在 SRL 檢測(cè)方案中，斯托克斯光束以固定頻率調(diào)制，由此產(chǎn)生的調(diào)制傳輸?shù)奖闷止馐?LIA 檢測(cè)。

二．實(shí)驗(yàn)裝置

使用的激光系統(tǒng)能夠輸出兩個(gè) 80 MHz 的激光脈沖序列：斯托克斯光束在 1030 nm，泵浦光束在 790 nm。激光輸出也用于同步調(diào)制：80 MHz 參考被發(fā)送到分頻器以生成 20 MHz TTL 輸出。這些 20 MHz 輸出被使用兩次：一次作為電光調(diào)制器調(diào)制斯托克斯光束的驅(qū)動(dòng)頻率，另一次作為外部鎖相環(huán)的 LIA 輸入通道 2（B 中）的參考。泵浦光束由硅光電二極管檢測(cè)，然后被發(fā)送到 LIA 的輸入通道 1（In A）。來(lái)自輸出通道 1（Out A）的信號(hào)被發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡以進(jìn)行圖像采集。來(lái)自輸出通道 2 (Out B) 的信號(hào)被最小化（通過(guò)調(diào)整相移）。

2.1 單通道鎖相放大器配置

圖 2 演示了用于 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)的 LIA 的初始設(shè)置。在初始設(shè)置時(shí)，必須重新獲取鎖相環(huán)。輸入均配置為 AC：50 歐姆。通過(guò)調(diào)整相位度數(shù)優(yōu)化相移 (Df)，直到 Out A 最大化（正值）并且 Out B 最小化（接近零）。探針A顯示對(duì)應(yīng)于 DMSO 最高信號(hào)峰 (2913 cm-1 ) 的 SRS 信號(hào)，并最大化輸出 A 的 103.3 mV。探針B表示正交輸出，最小化為零。一旦 LIA 針對(duì)校準(zhǔn)溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，樣品就可以進(jìn)行成像了。

圖 3 是使用 Moku:Pro 鎖相放大器拍攝的 HeLa 細(xì)胞圖像。顯示的圖像是從 SRS 圖像生成的，拉曼位移為 2930cm-1，對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)峰。低通濾波器設(shè)置為 40 kHz，對(duì)應(yīng)于 約4μs 的時(shí)間常數(shù)。可以根據(jù)SRS信號(hào)大小增加或減少增益。

2.2 雙通道成像

Moku:Pro 的 LIA 也適用于實(shí)時(shí)雙色 SRS 成像。這是通過(guò)在 SRS 成像中應(yīng)用正交調(diào)制并檢測(cè)LIA的X和Y輸出來(lái)執(zhí)行的。在這種情況下，斯托克斯調(diào)制有兩個(gè)部分：一個(gè) 20 MHz 脈沖序列生成SRS信號(hào)，另一個(gè) 20 MHz 脈沖序列具有90°相移，生成另一個(gè)針對(duì)不同拉曼波段的SRS信號(hào)[3]。由于90°相移，兩個(gè)通道（Out A和Out B）彼此正交，可以同時(shí)獲取兩個(gè)SRS圖像而不會(huì)受到干擾。

圖 4 是利用雙通道X&Y輸出同時(shí)在2930 cm -1和 2850 cm -1處生成兩個(gè) SRS 圖像的代表性圖像。

2.3多儀器模式應(yīng)用

在大多數(shù) SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中，由于激光器總帶寬的限制，光譜范圍被限制在大約 300 cm -1左右。繞過(guò)這一技術(shù)障礙的一種方法是使用可調(diào)諧激光器掃描波長(zhǎng)。然而，波長(zhǎng)調(diào)諧速度很慢，而且對(duì)于時(shí)間敏感的實(shí)驗(yàn)（如活細(xì)胞成像）來(lái)說(shuō)往往不夠。應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的另一種解決方案是引入第三束激光束來(lái)掃描不同的拉曼過(guò)渡區(qū)域。這種能力對(duì)于兩個(gè)光譜區(qū)域的同時(shí)成像特別有吸引力：一個(gè)在指紋區(qū)域（例如 約1600 cm-1用于酰胺振動(dòng)）和一個(gè)在CH區(qū)域（例如 約2900 cm -1蛋白質(zhì)）。在 SRL 成像方法中，實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)斯托克斯光束和兩個(gè)不同波長(zhǎng)的泵浦光束組成。此設(shè)置的常用檢測(cè)方法需要單獨(dú)的檢測(cè)器和單獨(dú)的 LIA。然而，Moku:Pro 的多儀器模式允許部署多個(gè)LIA，因此可以在不需要任何額外硬件妥協(xié)的情況下實(shí)施第二個(gè)LIA。

圖 5 演示了LIA 的多儀器模式設(shè)置，用于同步 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)。對(duì)于Slot 1，In 1是第一個(gè)光電二極管的檢測(cè)信號(hào)，In 2是參考信號(hào)，Out 1是發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡的信號(hào)，Out 3被丟棄。對(duì)于 Slot 2，In 3 是第二個(gè)光電二極管的檢測(cè)信號(hào)，In 2 再次作為參考，Out 2 是發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡的信號(hào)，Out 4 被丟棄。此配置僅使用 4 個(gè) Moku 插槽中的 2 個(gè)。插槽 3 和 4 未分配，因此可用于進(jìn)一步的 LIA 或任何其他 Moku 儀器。輸入全部配置為 AC：50 歐姆。每個(gè) LIA 插槽（1 和 2）都遵循與單通道 LIA 配置相同的設(shè)置。

在三個(gè)激光器的情況下，Moku:Pro 的多儀器模式可以配置兩個(gè)鎖定放大器，將系統(tǒng)簡(jiǎn)化為一個(gè)設(shè)備，而不會(huì)有任何妥協(xié)。這使得研究人員可以同時(shí)拍攝兩張波數(shù)差較大的 SRS 圖像，利用一個(gè) Moku:Pro 來(lái)處理兩個(gè)光電二極管檢測(cè)器信號(hào)。

圖 6 是利用一個(gè)Moku:Pro處理兩個(gè)光電二極管檢測(cè)器信號(hào)同時(shí)拍攝兩個(gè)大波數(shù)差的 SRS 圖像的代表性圖像。

三．結(jié)論

Moku:Pro 的 LIA 為大量 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)提供了出色的解決方案。在本文檔中，討論了典型的單通道 SRS 成像、雙通道成像和多儀器成像。用戶界面允許對(duì)提取低強(qiáng)度 SRS 信號(hào)進(jìn)行直觀和強(qiáng)大的控制。重要的是 Moku:Pro 的多儀器工具功能允許在多儀器同用的緊湊型系統(tǒng)上進(jìn)行復(fù)雜的成像實(shí)驗(yàn)。