2024年4月17日，上海交通大學生物醫(yī)學工程學院葉堅教授、邵志峰教授團隊在Nature期刊發(fā)表題為“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”的研究論文，上海交通大學生物醫(yī)學工程學院致遠榮譽計劃博士生畢心緣為論文第一作者，邵志峰教授、Daniel M. Czajkowsky教授為論文共同作者，葉堅教授為論文通訊作者。

該研究針對表面增強拉曼光譜領(lǐng)域內(nèi)定量的挑戰(zhàn)，系統(tǒng)闡述了基于數(shù)字膠體增強拉曼光譜（dCERS）的定量技術(shù)?；趩畏肿佑嫈?shù)，dCERS成功實現(xiàn)了超低濃度目標分子的可靠定量檢測，為表面增強拉曼光譜技術(shù)的普遍應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

研究團隊發(fā)明了數(shù)字膠體增強拉曼光譜（dCERS），利用膠體納米顆粒，可以實現(xiàn)較高效率的單分子檢測。雖然單分子信號強度波動巨大，這與過去的研究結(jié)果相吻合，但與常見的單分子表面增強拉曼光譜（SERS）技術(shù)不同的是，通過將光譜根據(jù)是否存在目標分子拉曼特征峰進行0/1數(shù)字化，亦即陰性光譜和陽性光譜（數(shù)字信號），隨后對溶液中的陽性光譜進行計數(shù)。通過該單分子計數(shù)的方式可以實現(xiàn)對多種分子（如染料分子、代謝小分子、核酸、蛋白）的定量檢測，定量檢測限可以達到1fM以下（圖1）。其中，dCERS技術(shù)所采用的膠體顆粒的合成步驟簡單，易于放大生產(chǎn)，在應(yīng)用中，可以方便地取出每個批次的少量顆粒來針對具體的目標分子預先建立標準曲線，從而可以可靠地用于后續(xù)未知濃度樣本的定量。

圖1. dCERS定量檢測原理與不同種類分子的定量標準曲線

在實驗中研究人員發(fā)現(xiàn)，這些通過閾值確定的單分子事件，其出現(xiàn)次數(shù)的分布完全符合泊松統(tǒng)計，因此通過陽性光譜的數(shù)量，可以直接簡單地確定定量靈敏度與準確性，這與傳統(tǒng)的基于模擬信號的定量方法完全不同。如圖2所示，通過增加檢測總光譜數(shù)，可以累積陽性光譜數(shù)量，從而有效提升定量的準確性，定量檢測誤差服從泊松噪聲。因此在真實應(yīng)用場景下，可以根據(jù)分子的檢出概率和對于準確性、檢測總時長等的需求，通過累積陽性光譜數(shù)來調(diào)控定量檢測的準確性，由此dCERS定量檢測具備精準可控的可重復性。

研究發(fā)現(xiàn)還證明，針對不同的目標分子，盡管濃度與單分子計數(shù)的依賴關(guān)系具有不同的系數(shù)（需要分別進行標定），這些關(guān)系都符合吉布斯熱力學的理論。事實上，這是首次明確建立了單分子統(tǒng)計的物理基礎(chǔ)，并可能適用于拉曼光譜之外的其它單分子計數(shù)技術(shù)。

圖2. dCERS定量檢測誤差服從泊松分布

為了確立dCERS在實際測量中的潛力，研究團隊選取了百草枯和福美雙作為展示實例（圖3）。百草枯是一種高效、劇毒的除草劑，可以誘導帕金森氏病的發(fā)生，目前已有32個國家嚴格禁止其使用。福美雙是一種含硫劇毒殺真菌劑，被歐盟歸為二類致癌物。因此，超高靈敏度、準確可靠的定量檢測技術(shù)對于這些分子的檢測非常重要，尤其是致癌物，原則上不存在安全劑量。

選取普通的湖水作為背景并混入微量的百草枯，研究團隊成功實現(xiàn)了低于歐盟最大殘留量規(guī)定三個數(shù)量級的檢測靈敏度。對于福美雙，研究團隊選取了實驗室培養(yǎng)的豆芽提取液，達到了優(yōu)于質(zhì)譜五個數(shù)量級的檢測靈敏度。并證明了，通過系列稀釋的方法，檢測中的背景干擾可以得到完美的抑制，從而實現(xiàn)準確的靶分子濃度的測量。而dCERS的超高靈敏度和可靠的統(tǒng)計分布是實現(xiàn)這些定量測量的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

圖3. dCERS在微量分子檢測中的應(yīng)用

總之，該研究展示了dCERS技術(shù)基于單分子計數(shù)實現(xiàn)了超低濃度目標分子在未知復雜背景中的可重復性定量，無需使用任何目標分子的特定標記。由于不同的目標分子大多具有獨特的SERS光譜，dCERS可以實現(xiàn)多種不同分子的同時定量檢測，因此具有很好的應(yīng)用前景。另外，這項工作使用的膠體納米顆粒可以方便地進行大規(guī)模生產(chǎn)和制備，而檢測方法相對簡單，因此，dCERS有望進一步推動高靈敏檢測技術(shù)的變革和進步。